一、為什么多肽樣品要先進(jìn)行預(yù)處理才能上制備柱？還有什么預(yù)處理方法？

回答：與用來分析的色譜柱相比，制備用的色譜柱由于處理了大量的樣品而更容易受到污染，對需要過柱的樣品進(jìn)行一些前處理可以有效地延長制備柱的使用壽命。

前處理方法主要有：萃取，過濾，離心，預(yù)柱等。

色譜柱

二、為什么在流動相中要加入三氟乙酸作離子對試劑？還可以使用什么流動相系統(tǒng)或離子對試劑來分離純化多肽？

回答：固拓生物目前使用的流動相系統(tǒng)是水加乙腈，它使用三氟乙酸作為離子對試劑。針對不同肽段選擇合適的梯度洗脫分離肽段。

同時，TFA可調(diào)節(jié)洗脫液PH值，作為離子對試劑與多肽相互作用，可增強(qiáng)分離效果，顯著改善樣品峰形。

流動相或離子對試劑也可用于多肽分離純化：醋酸體系、磷酸體系、鹽酸體系、七氟丁酸體系等。調(diào)整PH值同樣可以獲得良好的分離效果。

三、如何選擇提純時所用的色譜柱填料？

回答：不同序列在多肽的理化性質(zhì)和疏水性方面存在很大差異。大多數(shù)情況下，C18柱的分子量小于4000，親水多肽的分離效果最好。

以分子量大于5000，基端疏水性較好的多肽分離C4柱。

C8色譜柱介于C18和C4之間，其應(yīng)用效果偏向于C18；對于某些特別選擇性的多肽，還可用于苯基和聚合物色譜柱。

四、純化過程中聚合物填料的選擇原則有哪些？

回答：需要用溫度條件進(jìn)行或高于正常pH純化時；可以用pH范圍很寬的聚合物色譜柱。該方法具有在基端pH條件下不降解、用強(qiáng)酸和強(qiáng)堿作為流動相分離純化等優(yōu)點(diǎn)。

五、影響多肽純度檢驗(yàn)的因素是什么？

回答：肽類化合物純度測定結(jié)果受多種因素的影響，包括：流動相系統(tǒng)，色譜柱的類型，柱溫，波長和色譜儀的性能指標(biāo)，這些不同會導(dǎo)致測定結(jié)果的誤差。

六、反相層析分離提純后，如何從流動相產(chǎn)品中除去TFA、乙腈等雜質(zhì)？

回答：冷凍干燥的方法應(yīng)能去除大部分TFA和乙腈，只要超出許可范圍，這個方法就是簡單有效的。有些要求TFA含量較高的藥物肽凍干的方法通常不能完全達(dá)到要求，需要專門的鹽化或脫鹽。

七、多肽通常是什么類型的鹽？鹽的脫除是怎樣進(jìn)行的呢？

回答：大多數(shù)多肽是在TFA體系中分離純化的，因此，多肽的主要形式為TFA鹽，其次，藥物肽一般為醋酸鹽和鹽酸鹽，少數(shù)藥物肽會有一些特殊的鹽狀。以離子交換法、HPLC法為主，透析袋、超濾膜均可用于脫鹽。

八、TFA在緩沖液中的作用是否只是調(diào)節(jié)PH？基線漂移越大，TFA濃度越高，這是說當(dāng)緩沖液PH允許時，TFA濃度越低越好嗎？

回答：1.TFA作用類似于離子對，一般濃度為0.05-0.1%，濃度過高，會使溶液偏酸，長期使用可影響柱子壽命。

2.TFA對硅膠表面硅醇基有抑制作用，可改善堿性樣品的峰型。有時候，0.1%的TFA是不理想的。可考慮增加濃度至0.2%。但注意用完后要及時沖洗色譜柱。

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