背景及概述

蛋白質(zhì)僅僅用20種天然氨基酸執(zhí)行了一系列顯著功能，僅有的20種天然氨基酸攜有的功能基團(tuán)數(shù)量有限，無法滿足化學(xué)、生物科學(xué)研究和應(yīng)用中對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的需求。目前，通過化學(xué)修飾、基因定點(diǎn)突變和計算機(jī)輔助蛋白質(zhì)設(shè)計，雖然對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)改造賦予了天然蛋白質(zhì)新的功能，但這些方法都依賴于20種天然氨基酸本身；其用于修飾改造的功能基團(tuán)僅有巰基、羥基、羧基、氨基等幾種有限基團(tuán)，功能化方式十分有限。與此相反，可人為賦予多樣性功能基團(tuán)的非天然氨基酸(UnnaturalAminoAcids)在蛋白質(zhì)修飾中表現(xiàn)突出，這些非天然氨基酸含有酮基、醛基、疊氮、炔基、烯基、酰胺基、硝基、磷酸根、磺酸根等多樣性功能基團(tuán)，可進(jìn)行多種修飾反應(yīng)，如：點(diǎn)擊化學(xué)、光化學(xué)、糖基化、熒光顯色等反應(yīng)。通過非天然氨基酸對蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾給其結(jié)構(gòu)和功能的理論研究與應(yīng)用帶來了新的契機(jī)。

種類

一系列非天然氨基酸已經(jīng)被用在細(xì)菌、酵母和哺乳動物細(xì)胞中進(jìn)行蛋白質(zhì)修飾，其精確性和效率非常高；它們大多都是20種天然氨基酸的衍生物，現(xiàn)今報道的UAA衍生物有苯丙氨酸衍生物、酪氨酸衍生物、谷氨酰胺衍生物、丙氨酸衍生物、半胱氨酸衍生物、絲氨酸衍生物、賴氨酸衍生物等。

修飾方法與過程

1. 化學(xué)合成法

固相肽合成方法和半合成方法相結(jié)合能合成出含非天然氨基酸的大片段蛋白質(zhì)。例如，在化學(xué)連接中，一個C端含一硫脂的多肽將和一個N端含半胱氨酸的多肽反應(yīng)，在經(jīng)歷一個?；嘏藕?，硫脂鍵形成一個肽鍵將這兩個片段連接在一起。固相肽合成和連接技術(shù)已經(jīng)用于修飾蛋白質(zhì)骨架、紅細(xì)胞生成素同系物、熒光探針、信號蛋白、離子通道、組蛋白等。然而這項技術(shù)的應(yīng)用受所需要保護(hù)基團(tuán)的化學(xué)性質(zhì)、連接位點(diǎn)、蛋白質(zhì)折疊等限制。

2. 體外生物合成法

體外生物合成方法已經(jīng)合成了含UAA的蛋白質(zhì)。在這個技術(shù)中，縮短了的tRNAs被酶法連接到化學(xué)氨?；暮塑账嵘?，這些目的tRNA從連接的天然氨基酸上去耦掉，同時與非天然氨基酸結(jié)合；隨后細(xì)胞翻譯系統(tǒng)在相應(yīng)的空白密碼子或者編碼密碼子下，使用這些帶有非天然氨基酸的氨?；膖RNAs合成蛋白質(zhì)，但含有非天然氨基酸的氨?；痶RNA加合物穩(wěn)定性很差。

3. 顯微注射法

在體內(nèi)，通過顯微注射技術(shù)對蛋白質(zhì)進(jìn)行位點(diǎn)特異性修飾來自于體外生物合成方法的拓展。如非洲爪蟾蜍卵母細(xì)胞被顯微注射進(jìn)2種RNA：一種是編碼蛋白質(zhì)的mRNA，其目標(biāo)位點(diǎn)含有UAG終止密碼子；一種是合成的氨?；^tRNA(suppressortRNA)，它能裝載相應(yīng)的UAA。在體內(nèi)，通過UAG終止密碼子對蛋白質(zhì)進(jìn)行位點(diǎn)特異性修飾，其中非天然氨基酸有酪氨酸同系物、a一基氨基酸等。但它繼承了體外生物合成方法的缺點(diǎn)，即校正tRNA必須在體外化學(xué)氨?；瘞蟄AA，氨?；膖RNA不能被重復(fù)利用，只能應(yīng)用于能進(jìn)行顯微注射的細(xì)胞口。

4. 營養(yǎng)缺陷型法

50年以前，研究者發(fā)現(xiàn)許多天然氨基酸的同系物能抑制細(xì)菌的生長，分析發(fā)現(xiàn)在這些氨基酸同系物存在下合成的蛋白質(zhì)，其天然氨基酸已被同系物替換，這是因為氨酰-tRNA合成酶(aminoaeyl-tRNAsynthetase，aaRS)不能明顯地把天然氨基酸和其同系物嚴(yán)格區(qū)分開來，例如，正亮氨酸(norleucine)能被甲硫氨酰-tRNA合成酶識別，氟苯丙氨酸(p—fluorophenylalanine)能被苯丙氨酰一tRNA合成酶識別。同時用4(s)一氟脯氨酸，4-氟苯丙氨酸和6～氟色氨酸(3種非天然氨基酸對脂肪酶進(jìn)行修飾，其脂肪酶的結(jié)構(gòu)和活性均未被破壞。DNA聚合酶是一種高的動力學(xué)酶，用大腸桿菌營養(yǎng)缺陷型菌株對DNA聚合酶中32個脯氨酸替換成4(R)一氟脯氨酸(4(R)一fluoroproline，(4(R)一F)Pro)，完成了(4(R)一F)Pro對DNA聚合酶的修飾，而DNA聚合酶在其保真度、活性和敏感方面均未發(fā)生變化。但運(yùn)用營養(yǎng)缺陷性菌株來進(jìn)行非天然氨基酸對蛋白質(zhì)的修飾，沒有位點(diǎn)特異性、細(xì)胞不能持續(xù)生長，且非天然氨基酸僅是天然氨基酸的同系物。

5. 翻譯后修飾法

蛋白質(zhì)翻譯后修飾在生命體中具有十分重要的作用，它使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜，功能更為完善，調(diào)節(jié)更為精細(xì)，作用更為專一。常見的蛋白質(zhì)翻譯后修飾過程有泛素化、磷酸化、糖基化、脂基化、甲基化和乙酰化等。通過在麥芽糖結(jié)合蛋白、人類生長激素和分枝桿菌磺基轉(zhuǎn)移酶蛋白中，引入一個含6個氨基酸的共有序列(LCTPSR)，它能被甲酰甘氨酸生成酶識別并修飾，從而生成醛基基團(tuán)，新生成的醛基基團(tuán)能進(jìn)一步引人生物物理探針和抗原表位標(biāo)簽到蛋白質(zhì)中。用疊氮基酪氨酸(3-azidoty—rosine)對鈣調(diào)蛋白進(jìn)行修飾，再用三芳膦同系物對其進(jìn)行選擇性的生物?；揎?，從而開創(chuàng)了一種新的蛋白質(zhì)位點(diǎn)選擇性翻譯后修飾方法。

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應(yīng)用現(xiàn)狀和前景

1. 生物催化

1)提高酶催化活性

在生物技術(shù)領(lǐng)域，酶經(jīng)過化學(xué)修飾后能夠在有機(jī)溶劑中高效地發(fā)揮催化作用，并表現(xiàn)出新穎的催化性能。現(xiàn)在研究者也引入許多催化基團(tuán)到蛋白質(zhì)中，細(xì)菌磷酸三酯酶PTE)以非常快的轉(zhuǎn)化效率催化農(nóng)藥對氧磷水解，其活性已接近進(jìn)化限制。利用tRNA'cu／TyrRS對，用L一(7-羥基香豆素一4一基)乙基甘氨酸或L一(7一甲基香豆素一4一基)乙基甘氨酸(對PTE進(jìn)行修飾，其PTE的催化效率提高了8～11倍，這為酶的分子改造提高其活性提供了一條新的思路。

2)增強(qiáng)酶熱穩(wěn)定性

特氟龍能使阻燃和防火氟化高分子材料表面固化，受此啟發(fā)，紐約大學(xué)金·蒙克萊爾研究小組開創(chuàng)了一種能增強(qiáng)蛋白質(zhì)界面的工藝過程。借助營養(yǎng)缺陷性菌株和在培養(yǎng)基中加入對氟苯丙氨酸，制備了對氟苯丙氨酸磷酸酯酶，性能測試顯示，這種酶蛋白具有類似于特氟龍的耐熱性能，在60℃的高溫下仍可保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，同時活性和功能沒有絲毫減弱。在同樣溫度下，天然蛋白質(zhì)分子中的氫鍵會斷裂，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)改變并發(fā)生蛋白質(zhì)變性。通過此氟化氨基酸對蛋白質(zhì)的修飾，給蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定研究開辟了新的視野。

2. 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能探針

光誘導(dǎo)化學(xué)反應(yīng)存在自然界中，它能調(diào)節(jié)許多細(xì)胞和生物功能，Wang等。用光反應(yīng)非天然氨基酸對一(2一四唑)苯丙氨酸(p-(2一tetrazole)phenylalanine，(p-Tpa))對肌紅蛋白進(jìn)行修飾，這給用光來調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能提供了可能。對甲氧基苯丙氨酸([C]p—methoxypheny1alanine)對P450進(jìn)行修飾，修飾后P450和其它原子結(jié)合，可以用來闡明P450在配體位點(diǎn)的構(gòu)象改變，同時也可以解釋哺乳動物P450的復(fù)雜動力學(xué)現(xiàn)象。

3. 藥物蛋白

在醫(yī)療蛋白開發(fā)上，大量同源修飾蛋白的產(chǎn)生是理想的_5。如對許多抗原和抗原決定簇來說，一個強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)是需要的，利用校正tRNAcLyur／TyrRS對，用對乙酰苯丙氨酸(p-acety|一phenylalanine)對抗體抗原結(jié)合片段進(jìn)行修飾，這給多聚物醫(yī)療蛋白的產(chǎn)生提供了可能。

4. 蛋白質(zhì)交聯(lián)反應(yīng)

蛋白質(zhì)交聯(lián)在疫苗開發(fā)、藥物傳遞、功能型水合膠方面發(fā)揮著重要作用。這些交聯(lián)雖然發(fā)生在自然中，但實驗室很難應(yīng)用這個方法。通過3，4一二羥一L一苯丙氨酸(3，4-dihydroxy—L-phenylala—nine)對GFP蛋白進(jìn)行修飾，從而實現(xiàn)了蛋白質(zhì)與多聚糖的生物交聯(lián)，這給蛋白質(zhì)交聯(lián)和合成生物學(xué)的發(fā)展帶來了新的希望。用對炔丙基氧苯丙氨酸(p-propargyloxyphenyla1anine，(pPa))完成了二氫葉酸還原酶和超折疊綠色熒光蛋白的修飾，由于pPa含有酮基，它能在一價銅離子介導(dǎo)下使炔基與疊氮基發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，同時pPa對UV不敏感，這使異源蛋白質(zhì)間的交聯(lián)也成為了可能。

制備

一種制備非天然氨基酸及其手性拆分的方法，本法以金剛烷甲酸為原料，制備3-羥基金剛烷甲酸，再經(jīng)過氯化、氧化等得到2-(3-羥基-1-金剛烷基)乙醛酸，與鹽酸羥胺反應(yīng)得到3-羥基金剛烷乙醛酸肟，用還原劑還原并用Boc酸酐保護(hù)得到N-叔丁氧羰基-3-羥基金剛烷基甘氨酸。再用有機(jī)堿拆分得到(S)-N-叔丁氧羰基-3-羥基金剛烷基甘氨酸和(R)-N-叔丁氧羰基-3-羥基金剛烷基甘氨酸兩種非天然氨基酸。本發(fā)明與已有技術(shù)相比，改進(jìn)了合成工藝，反應(yīng)條件溫和，環(huán)境污染小，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

寫到最后：

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