齊考諾肽（Ziconotide）可用于醫(yī)治神經(jīng)性和非神經(jīng)性疼痛 。 Ziconotide通過與位于傷害體會(huì)方式初級(jí)傳入神經(jīng)元末端的N型鈣通道 (N-typecalciumchannels)結(jié)合而起功效 ，從而減少突觸傳遞并具備有效的抗傷害功效 。

齊考諾肽作為 一種環(huán)型 肽，且含有三對(duì)二硫鍵 ，其氨基酸序列為：H-Cys(1)-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys(2)-Ser-Arg-Leu-Met -Tyr-Asp -Cys(3)-Cys(1)-Thr-Gly-Ser-Cys(2)-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys(3)-NH2，其三對(duì)二硫鍵的配對(duì)已在序列中表示出。

齊考諾肽（Ziconotide）3D化學(xué)式，作為 一種含多對(duì)二硫鍵的環(huán)肽 ，人工合成 時(shí)使分子式中的二硫鍵準(zhǔn)確產(chǎn)生是人造的一個(gè)難題 。 

通過巰基氧化 產(chǎn)生多肽分子式中的二硫鍵時(shí)，只含一對(duì)二硫鍵時(shí)很容易挑選反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn) ，如通過氣體 ，I2 ，H2O2 ，汞鹽等氧化 ，可是 ，像齊考諾肽那樣必須氧化產(chǎn)生三對(duì)二硫鍵的情況較為復(fù)雜，反應(yīng) 會(huì)產(chǎn)生多種多樣同分異構(gòu)體 ，因而需選用適宜的氧化方式 ，即可選擇性氧化 。

要實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，一般是選用不一樣的硫基維護(hù)基的氧化差異來做到規(guī)定 ，齊考諾肽的三對(duì)二硫鍵各自以氣體 ，碘作為氧化物 ；通過差異氧化先產(chǎn)生由Trt維護(hù)的1-8，16 -20兩對(duì)二流鍵，再通過經(jīng)典氧化產(chǎn)生由Acm維護(hù)的15 -25 二硫鍵；氧化全過程由MS ，HPLC 檢測(cè) ，以后 由HPLC 純化得到成品 。

齊考諾肽線性肽的固相生成

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環(huán)氧樹脂媒介的制取

反應(yīng)罐中加入 Fmoc-Linker-MB -HA -Resin環(huán)氧樹脂 ，用DCM溶脹，排干，加入20 %(摩爾分?jǐn)?shù) ，相同 )吡啶 /DMF 溶液 ，震蕩反應(yīng)20 min ，去除Fmoc官能團(tuán) ，用DMF清洗 3遍，排干。 

加入 Fmoc-Cys(trt)-OH ，TBTU，HOBT和DIEA，N2震蕩反應(yīng)1h，用DMF清洗環(huán)氧樹脂去除不必要的FmocCys(trt)0H制得聯(lián)接環(huán)氧樹脂 。

2

線性肽鏈的生成 （經(jīng)營(yíng)規(guī)模 ：AA ：HB ：DIEA=1:3:3:6），去除 Fmoc維護(hù)基：向配有聯(lián)接環(huán)氧樹脂的反應(yīng) 柱中加入 20 %吡啶 /DMF 溶液 ，震蕩反應(yīng)20min 。 

用DMF清洗環(huán)氧樹脂3遍，產(chǎn)生肽鍵：向反應(yīng)柱中加入定量分析的維護(hù)碳水化合物 (用DMF10mL融解，加入定量分析的HBIU和DIEA)，N2 震蕩反應(yīng)1h。排干 ，用DMF清洗3遍。

肽鏈增加：將前一步生成的環(huán)氧樹脂肽作為下一步生成的羥基成分，反復(fù)以上接肽全過程 ，開展 25次接肽反應(yīng)制得環(huán)氧樹脂線性肽鏈 。

檢驗(yàn)反應(yīng)過程 ：用茚三酮顯色劑法律性檢驗(yàn)反應(yīng)過程 ，分辨各步接肽的終點(diǎn)站 ，第-步去除Fmoc維護(hù)基中若環(huán)氧樹脂肽呈深藍(lán)色 ，表明Fmoc維護(hù)基已去除 。 

若在產(chǎn)生肽鍵流程中若環(huán)氧樹脂肽呈深藍(lán)色 ，表明反應(yīng)不徹底 ，需再度縮合反應(yīng) ，當(dāng)環(huán)氧樹脂肽呈無色全透明狀，表示羥醛縮合順利完成 。

3

環(huán)氧樹脂線性肽鏈的激光切割，在燒瓶中加入干躁的環(huán)氧樹脂線性肽鏈 ；TFA ，EDT ，對(duì)甲苯酚，苯甲乙酰氯和水（87.5:5:2.5 :2.5 :2.5 ），攪拌下于室溫反應(yīng)2h。 

旋蒸 ，洗劑與滲瀝液合拼，用沒有水醫(yī)用乙醚 (5倍~10倍量 )析晶，離心分離機(jī) ，沉積用小量沒有水醫(yī)用乙醚清洗 ，真空干燥機(jī)得粗肽。

4

粗品的分離純化

HPLC 純化標(biāo)準(zhǔn) ：C18柱，粒度 5μm，檢驗(yàn)波220 mm ，沖洗掉液A：0.1 %TFA 溶液 ;沖洗掉液B：0.1 %TFA 乙腈溶液 ;挑選沖洗掉梯度方向10 %~100 %，沖洗掉時(shí)間15 min，流動(dòng)速度1mL /min ，粗肽經(jīng)HPLC純化制得純的線性肽。

5

二硫鍵的產(chǎn)生

（1）第一步氧化產(chǎn)生兩對(duì)二硫鍵 

在燒杯中加入純品線性肽，純凈水，用氨水調(diào)至pH8上下 ，攪拌下于室溫反應(yīng) 24 h。 濃縮制得粗肽，經(jīng)HPLC純化制得含2個(gè)二硫鍵的肽段，齊考諾肽（Ziconotide）只有兩對(duì)二硫鍵時(shí)的3D化學(xué)式

（2）第二步氧化產(chǎn)生第三對(duì)二硫鍵 

在燒瓶中加入以上得到的肽段，25 %甲醇溶液 和碘8eq ，攪拌下于室溫反應(yīng) 2h，滴入硫代硫酸鈉至溶液無色 ，濃縮制得粗肽，經(jīng)HPLC純化制得成品 。

寫到最后：

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