簡(jiǎn)述蛋白質(zhì)、多肽液相色譜純化方法及準(zhǔn)備工作 

1、純化的常見目標(biāo)和辦法

第一，自然來源亦或是重組表達(dá)的蛋白質(zhì)歷經(jīng)部分粗提的流程變成相對(duì)穩(wěn)定的可用作色譜分離的樣本。然后通過捕捉色譜，總體目標(biāo)是濃縮和除掉大批量的比較容易消除的雜質(zhì)，此步最看重的是流動(dòng)速度和載量，常使用高載量、快流速凝膠。完成濃縮的那部分純化的樣品做好中級(jí)色譜，作用是去掉比較難消除的雜質(zhì)，此步最看重的是分辨率，常使用高分辨率的細(xì)顆粒凝膠。最終為了獲得滿足條件的最終產(chǎn)品，除去殘余的雜質(zhì)還有目標(biāo)蛋白的多聚物或是降解片段，展開精制色譜，常選用擁有高分辨率的凝膠過濾凝膠進(jìn)行凝膠過濾色譜。

2、純化的前期準(zhǔn)備工作

（1）樣本穩(wěn)定性測(cè)試

a、檢測(cè)試樣在pH2-9系統(tǒng)的穩(wěn)定性；b、檢測(cè)試樣在0-4mol/LNaCl及0-2mol/L硫酸銨中系統(tǒng)穩(wěn)定性；c、檢測(cè)樣品在0-50%乙醇、甲醇中的穩(wěn)定性；d、檢測(cè)樣品在4-40℃的穩(wěn)定性；e、常溫下放置隔夜，測(cè)量對(duì)蛋白水解酶的穩(wěn)定性。

（2）樣品預(yù)處理

a、除去樣品中顆粒物體b、去除樣品中脂類c、去除樣品中核酸d、遏制樣品中蛋白水解酶。

（3）樣品的存放環(huán)境：短時(shí)間存儲(chǔ)

a、防止達(dá)到或超過樣品的穩(wěn)定限制避免蛋白質(zhì)變性或積淀b、在密封容器中冰箱保鮮較長(zhǎng)時(shí)間存放c、加進(jìn)恰當(dāng)?shù)囊志鷦╅L(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)藏冷凍或是盡量?jī)龈杀４妗?/span>

3、對(duì)每個(gè)純化方法步驟的評(píng)價(jià)有關(guān)辦法的建立

a、目標(biāo)蛋白含量測(cè)量酶活性測(cè)定、生物活性檢驗(yàn)、放射免疫、酶聯(lián)免疫、免疫電泳、熒光。b、總蛋白含量測(cè)定紫外吸收法、Lowry法、Bradford染料結(jié)合法等。c、樣品復(fù)雜性檢驗(yàn)HPLC、SDS-PAGE、等電聚焦、毛細(xì)管電泳(CE)。

4、蛋白質(zhì)來源

（1）純天然蛋白：天然產(chǎn)物中的目標(biāo)蛋白通常成分非常少并且成分比較復(fù)雜，在分離流程中須選用多步驟才可以除去各種各樣雜質(zhì)，并應(yīng)在操作過程中減少蛋白水解酶的活力。

（2）重組蛋白：重組蛋白則目標(biāo)蛋白的豐度較高。重組蛋白主要由以下三種表達(dá)定位：

a、細(xì)胞質(zhì)：一定要損壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)才能獲得目的蛋白質(zhì)，而且還伴有大量核酸以及其它上千種宿主蛋白質(zhì)的釋放；在表達(dá)量相對(duì)較高的環(huán)境下，通常生成包涵體，包涵體富含過表達(dá)目的蛋白，而且容易通過高速離心分離，可是包涵體的溶解與復(fù)性是較為繁瑣的。

b、外周質(zhì)：表達(dá)的蛋白質(zhì)分布于細(xì)菌內(nèi)膜與外膜中間，這種目的蛋白能夠很少地遭受蛋白酶的作用并降低了宿主蛋白的污染。

c、分泌到培養(yǎng)基：這樣的表達(dá)通常蛋白質(zhì)濃度不高，主要是受到培養(yǎng)基當(dāng)中的環(huán)境污染。

寫到最后:

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