分析色譜比較常見(jiàn)的吸附劑顆粒直徑為5μm，制備色譜經(jīng)常使用的吸附劑顆粒直徑更加大。特別是加樣量超出樣品存儲(chǔ)量時(shí)（柱過(guò)載），柱效與分析色譜相比影響比較小。當(dāng)柱過(guò)載時(shí)，大顆粒直徑填充柱同小顆粒直徑填充柱分離蛋白和多肽的效果差不多。所以，制備色譜較常用10μm及以上顆粒直徑的吸附劑。粒徑分布通常都比較寬。與0.5μm或更窄的粒徑分布范圍不一樣的是，制備色譜的粒徑范疇更廣，比如10~15μm。制備色譜柱成本較低，所以一般會(huì)選擇選用大粒子。

1、柱內(nèi)徑

因?yàn)闃悠反鎯?chǔ)量比較低，純化流程不怎么使用內(nèi)徑低于2mm的小孔柱。大批量多肽時(shí)，使用10mm和22mm內(nèi)徑的柱子。1mg蛋白或多肽的純化也可以采用10mm柱子，5mg純化可采用22mm柱子。大批量蛋白或多肽的純化采用50mm、100mm或內(nèi)徑更大的大內(nèi)徑柱子。

2、柱長(zhǎng)

與分析柱比起來(lái)，制備柱通常較為短。因?yàn)樵谥苽渖V法中，柱的總體積比柱長(zhǎng)更為重要，尤其是蛋白的分離。

內(nèi)徑60cm、柱長(zhǎng)12-15cm（“圓餅狀”柱）的色譜柱已運(yùn)用在蛋白的大規(guī)模純化中。因?yàn)樵谥苽渖V法中，柱通常過(guò)載，且收益的重要程度比不上總產(chǎn)量、純度及通量重要，所以按照其實(shí)用價(jià)值而不是經(jīng)濟(jì)效益改進(jìn)柱尺寸。

3、流動(dòng)相組成

與分析色譜法相同，使用10~22mm內(nèi)徑柱的較小規(guī)模純化較常用乙腈-TFA體系。大規(guī)模的純化一般使用乙醇等溶液取代乙腈，選用乙酸代替TFA。雖然選用這種溶劑作流動(dòng)相會(huì)降低分辨率，但是它們更加適合大規(guī)模的應(yīng)用，且分辨率的下降與柱過(guò)載既有的分辨率損害一致

4、蛋白變性

普遍認(rèn)為反相色譜可以讓蛋白變性，所以洗脫得出來(lái)的蛋白并非天然蛋白，且很有可能沒(méi)有生物活性。即使反相HPLC的操作要求會(huì)讓蛋白變性，但洗脫后依然可以獲得天然、具備生物活性的蛋白。

基于二硫鍵的作用，蛋白維持球形構(gòu)造，且只出現(xiàn)局部去折疊，所以從反相柱洗脫出來(lái)的蛋白往往可通過(guò)在恰當(dāng)?shù)闹卣郫B緩沖液中處理，進(jìn)而復(fù)原其天然結(jié)構(gòu)而恢復(fù)至tian然狀態(tài)。

很多案例顯示采用反相HPLC純化之后的蛋白仍保持天然三級(jí)結(jié)構(gòu)和生物活性。胰蛋白酶的反相純化，當(dāng)中活性得到了保留，且緊接著用來(lái)蛋白的胰蛋白酶酶切。

寫(xiě)到最后:

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