1. 如何維護(hù)色譜柱？

答：①建議在檢測(cè)前過(guò)濾樣品和流動(dòng)相。

②建議每天完成樣品后及時(shí)清洗。

③常規(guī)檢測(cè)：測(cè)試后，將色譜柱直接反向連接，用90%的有機(jī)相沖洗45分鐘，最后保存在純甲醇或純乙腈中。

④使用緩沖鹽條件：

a.等度條件：在使用緩沖鹽之前和之后，以1ml/min流速?zèng)_洗45min。

b.梯度條件：在使用緩沖鹽之前，與初始流動(dòng)相相同的過(guò)渡流動(dòng)相以1ml/min流速?zèng)_洗45min。

注意

①過(guò)渡流相是指有機(jī)相和水相的比例與分析流相同，但不含緩沖鹽。

②緩沖鹽沖洗后，用90%有機(jī)相反沖洗60分鐘，最后保存在純有機(jī)溶劑中。

③使用緩沖液不能在色譜柱中過(guò)夜。

2.氨基柱在進(jìn)入酸性樣品時(shí)，對(duì)柱非常有害，如使用一段時(shí)間后，柱效降低，峰形變化，如何恢復(fù)？

答：5-10倍柱體積含0.5-1.0％乙腈-水(50:50)溶液沖洗柱(沖洗后當(dāng)然要用無(wú)堿流動(dòng)相沖洗多余氨)，然后分析這類酸性分析物時(shí)，建議在流動(dòng)相中加入少許氨，如0.1％。

3.液相色譜中峰出現(xiàn)拖尾或雙峰的原因是什么？

答：①篩板堵塞或柱失效，解決辦法是反向沖洗柱子，更換篩板或柱子。

②有干擾峰，解決辦法是使用較長(zhǎng)的柱子，更換流動(dòng)相或更換選擇性好的柱子。

③柱子可能超載，減少進(jìn)樣量。

4.HPLC靈敏度不足的主要原因及解決辦法是什么？

答：①樣品量不足，解決辦法是增加樣品量。

②樣品不從柱子中流出，可根據(jù)樣品的化學(xué)性質(zhì)改變流動(dòng)相或柱子。

③樣品與檢測(cè)器不匹配，根據(jù)樣品的化學(xué)性質(zhì)調(diào)整波長(zhǎng)或更換檢測(cè)器。

④檢測(cè)器衰減過(guò)多，可以調(diào)整衰減。

⑤探測(cè)器的時(shí)間常數(shù)太大，解決辦法是降低時(shí)間參數(shù)。

⑥檢測(cè)器池窗污染，解決辦法是清洗池窗。

⑦檢測(cè)池內(nèi)有氣泡，解決辦法是排氣。

⑧如果記錄儀測(cè)壓范圍不當(dāng)，可以調(diào)整電壓范圍。

⑨流動(dòng)相流量不合適，調(diào)整流速即可。

⑩檢測(cè)器和記錄儀超過(guò)校正曲線，解決辦法是檢查記錄儀和檢測(cè)器，重作校正曲線。

5.做HPLC分析時(shí)，柱壓不穩(wěn)定，原因是什么？如何解決？

答：①泵內(nèi)有空氣，解決辦法是清除泵內(nèi)空氣，對(duì)溶劑進(jìn)行脫氣處理。

②比例閥失效，更換比例閥即可。

③泵密封墊損壞，更換密封墊即可。

④溶劑中的氣泡，解決辦法是對(duì)溶劑進(jìn)行脫氣，必要時(shí)改變脫氣方法。

⑤系統(tǒng)檢漏，找出泄漏點(diǎn)，密封即可。

⑥梯度洗脫，此時(shí)壓力波動(dòng)正常。

6.HPLC柱驗(yàn)收測(cè)試時(shí)柱壓過(guò)高，請(qǐng)問為什么？

答:柱壓過(guò)高是HPLC柱用戶最常遇到的問題。原因有很多，往往不是柱子本身的問題。您可以按照以下步驟檢查問題的原因:

①拆下保護(hù)柱，看柱壓是否還高，否則就是保護(hù)柱的問題，如果柱壓還高，再檢查一下。

②從儀器上取下色譜柱，看壓力是否下降，否則管道堵塞，需要清洗，如果壓力下降，再次檢查。

③將柱子的進(jìn)出口反過(guò)來(lái)連接到儀器上，用10倍柱體積的流動(dòng)相沖洗柱子（此時(shí)不要連接檢測(cè)器，防止固體顆粒進(jìn)入流動(dòng)池）。此時(shí)，如果柱壓仍不下降，請(qǐng)?jiān)俅螜z查。只用于使用過(guò)的柱子。

④更換柱入口篩板。如果柱壓降低，則表明您的溶劑或樣品中含有顆粒雜質(zhì)。正是這些雜質(zhì)堵塞了篩板，導(dǎo)致壓力上升。如果柱壓仍然很高，請(qǐng)聯(lián)系制造商。一般來(lái)說(shuō)，在進(jìn)樣器和保護(hù)柱之間連接在線過(guò)濾器可以避免柱壓過(guò)高的問題。

7.為什么會(huì)出現(xiàn)峰寬？

答：①樣品體積過(guò)大：用流量配樣，總樣品體積小于第一峰的15%。

②在進(jìn)樣閥中引起峰擴(kuò)展：進(jìn)樣前后排出氣泡以減少擴(kuò)散。

③數(shù)據(jù)系統(tǒng)采樣速度過(guò)慢：設(shè)定速率應(yīng)大于每峰10點(diǎn)。

④流動(dòng)相粘度過(guò)高：提高柱溫，采用低粘度流動(dòng)相。

⑤檢測(cè)池體積過(guò)大：用小體積池，卸下熱交換器。

⑥保留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)：等度洗脫時(shí)增加強(qiáng)溶劑含量，也可采用梯度洗脫。

⑦柱外體積過(guò)大：將連接管的直徑和長(zhǎng)度降到最低。

⑧樣品過(guò)載：進(jìn)入小濃度小體積樣品。

8.流動(dòng)相氣泡的原因是什么？

答：①由于有氧氣或空氣的溶解，流動(dòng)相溶液中經(jīng)常形成氣泡。

②液路阻力較大，吸液時(shí)出現(xiàn)真空氣泡。

③當(dāng)系統(tǒng)開始工作時(shí)，無(wú)法清除流路中的空氣。

④注入樣品時(shí)混入空氣。

9.實(shí)驗(yàn)室脫氣的常用方法有哪些？

答：①加熱回流脫氣，脫氣效果最好，但不能保持。

②氦氣脫氣，這種方法脫氣效果好，能去除90%以上的空氣，但氦氣價(jià)格太貴，所以用的不多。

③真空脫氣，效果僅次于氦脫氣，但在脫氣過(guò)程中容易造成樣品溶液揮發(fā)損失。

④超聲波脫氣，只能去除約30%的空氣，但最常用于實(shí)驗(yàn)室。目前仍盡量使用在線脫氣，方便，效果好。

10.氨基柱在進(jìn)入酸性樣品時(shí)，對(duì)柱非常有害，如使用一段時(shí)間后，柱效降低，峰形變化，如何恢復(fù)？

答：5-10倍柱體積含0.5-1.0％乙腈-水(50:50)溶液沖洗柱(沖洗后當(dāng)然要用無(wú)堿流動(dòng)相沖洗多余氨)，然后分析這類酸性分析物時(shí)，建議在流動(dòng)相中加入少許氨，如0.1％。

寫到最后:

杭州固拓生物科技有限公司定制多肽合成業(yè)務(wù):藥物肽、臨床肽、訂書肽、淀粉肽、醛肽、環(huán)肽、二硫鍵搭橋多肽、穿膜肽、各種抗菌肽、美容肽、磷酸化肽、PEG肽、偶聯(lián)BSA和KLH抗原肽、各類酸修飾多肽、各種胺類化合物修飾多肽(苯胺、異戊胺、二乙胺)、各類榮光標(biāo)記(FITC、FAM系列、DOTA、TAMRA系列、CY系列)同位素肽等。固拓生物所有產(chǎn)品僅限科研使用，不得用于人體，如有違反，后果自負(fù)。

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